特集2：基質特異性拡張型β-ラクタマーゼ産生菌

石井 良和 先生 東邦大学医学部微生物・感染症学講座

　基質特異性拡張型β-ラクタマーゼ産生菌 (Extended-spectrum β-lactamase: ESBL)は、CDC（米国疾病管理予防センター）から、人類に深刻な脅威を与える耐性菌として警戒されている。米国では年間26,000人がESBL産生菌による感染症を発症し、その内1,700人が死亡していると推定されている(http://www.cdc.gov/drugresistance/threat-report-2013/pdf/ar-threats-2013-508.pdf)。ESBL産生菌による感染症は、尿路感染が中心であること、カルバペネム系薬など治療に有効な抗菌薬が存在するなどの理由から、あまり注意を払われていないのも事実である。一方で、ESBL産生菌感染症の治療にカルバペネム系薬が汎用されると、その使用量の増加がカルバペネム耐性菌増加に繋がることも懸念される。さらに、ESBL産生菌は、病院内のみならず市中で健常人の感染症の原因菌となることから、外来での治療に有用な抗菌薬が少ないことも問題の一つである。
　本稿ではESBL産生菌の現状とその特徴、さらにESBL産生菌の検出方法、治療薬の選択などに関して私見を交えて議論する。

　基質特異性拡張型β-ラクタマーゼ産生菌 (Extendedspectrum beta-lactamase: ESBL)は、1983年にKnotheらがセフォタキシム、セフォキシチン、セファマンドールおよびセフロキシム対して耐性を示す肺炎桿菌およびSerratia marcescensについて報告した[1]。この耐性因子は、接合伝達実験で耐性菌から感性菌に伝達されたことから、伝達性プラスミド上にその遺伝子が存在することが推察された。その後、本酵素 (SHV-2)は、狭域な基質特異性を示すSHV-1が起源酵素であり、その違いは1アミノ酸残基のみであることが判明した[2]。すなわち、これまで狭域だった基質特異性がアミノ酸の変異が生じた結果、これまで分解できなかった基質を分解する能力を獲得（基質特異性拡張）したことから、ESBLと呼ばれるようになった。当初はESBLとして、多くのTEM-1、TEM-2およびSHV-1の変異酵素が報告された[3]。その産生菌の多くが肺炎桿菌であり、院内感染の原因菌として分離された[4]。TEM型あるいはSHV型ESBLの酵素学的特徴は、一部の酵素を除き、セフォタキシムと比較してセフタジジムを効率よく加水分解することである[3]。 　日本で検出頻度が高いESBLは、上述のTEM型やSHV型の変異酵素ではなく、CTX-M 型である。CTX-M 型酵素の起源酵素は、Kluyvera 属菌の染色体上にその遺伝子が存在するβ-ラクタマーゼである[5, 6]。その名の通り、CTX-M型酵素は、セフォタキシムを効率よく分解することが特徴である[3]。初めてこのタイプのβ-ラクタマーゼが検出されたのは1988年で、抗菌薬治験中の実験動物から分離された大腸菌より抽出・精製され、その酵素学的性質が報告された[7]。その2年後にはドイツのBauernfeindらが、臨床材料から分離された大腸菌が産生するセフォタキシム分解酵素について報告した[8]。しかし、上述の論文は、DNA 塩基配列あるいはアミノ酸配列に関する情報を含んでいなかった。1992年、BarthélémyらはMEN-1と命名したβ-ラクタマーゼのアミノ酸配列がKlebsiella oxytocaが産生するβ-ラクタマーゼとアミノ酸配列の類似性が高いことを報告した[9]。その3年後の1995年、筆者らがToho-1と命名した酵素のDNA塩基配列を初めて報告し、Toho-1はMEN-1やK. oxytoca が産生するβ-ラクタマーゼと80% 程度のアミノ酸レベルの類似性を示すことを報告した[10]。その1年後の1996年、 BauernfeindらがCTX-M-2の塩基配列を明らかにし、推定されるアミノ酸配列がToho-1と1残基のみ異なることを報告した[11]。その後、多くのCTX-M- 型酵素が報告され、2000年以降はこのグループに属するβ-ラクタマーゼが主要なESBLとして世界中に拡散した[12, 13]。 　CTX-M- 型はセフタジジムと比較してセフォタキシムをよく分解することは知られている。本邦以外の国々で検出頻度が高いCTX-M-15および本邦で検出頻度が高いCTX-M-27は、それぞれCTX-M-3およびCTX-M-9と240番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された、すなわち1アミノ酸残基のみ異なる酵素である。これらの酵素の特徴はセフォタキシムとセフタジジムの両方を効率良く分解することである[14-16]。一方、CTX-M-19もCTX-M-3の167番目のプロリンからセリンに1アミノ酸残基のみの置換が認められるが、セフォタキシムに対する活性を犠牲にしてセフタジジムを分解できるようになったβ-ラクタマーゼであることが知られている[17]（図1）。

　臨床材料から分離されるESBL産生大腸菌の多くがフルオロキノロン系薬に対しても耐性を示す。ESBL産生大腸菌をmultilocus sequence typingという手法で遺伝学的背景を解析すると、2000年を境にSequence Type (ST) 131という特定起源株が臨床材料から分離される大腸菌の中で優勢になった。大腸菌ST131のO 抗原を解析すると、O16とO25の2種類のO 抗原型を示すものが優勢であるが、Ｏ16とＯ25を含む全Ｈ30のフルオロキノロン系薬に対する耐性率には差があり、それぞれ7-19%、および84-100%である[18, 19]（表1）。
　大腸菌ST131は、宿主細胞に接着する際に重要な1型の線毛を有しており、その遺伝子 (fimH)配列をもとにさらに詳細な解析が可能である。このfimH遺伝子による細分類でH30R に分類されているフルオロキノロン耐性大腸菌は、2000年頃にフルオロキノロン感性H30株から派生し、急速に拡散したと考えられている。この大腸菌fimH30の中でも特にfimH30-Rxと命名された同一変異を有するクローンは、高率にESBL を産生する。fimH30-RxとfimH30-non-Rxのセフトリアキソンに対する耐性率は、それぞれ6% および77-89%と大きく異なっている[18, 20, 21]。
　これまでCTX-M-型ESBL産生大腸菌はST131あるいはO25bと関連することが指摘されてきたが、それらのクローンに分類される大腸菌の中でも、特定のサブクローン (fimH30-Rx)が多剤耐性化していることが明らかになった。2000年以降大腸菌が産生する主要ESBLがCTX-M- 型酵素に置き換わり、同β-ラクタマーゼ産生株が世界を席巻している理由の一つにST131fimH30-Rxの拡散と関連することが強く示唆される[21]。

　Clinical and Laboratory Standards Instituteのドキュメントに記載されているESBL産生菌のスクリーニング方法および確認方法は優れた方法である（表2）。現在、大腸菌、肺炎桿菌およびProteus milabirisが産生する多くのESBLがCTX-M-型β-ラクタマーゼである[22]。このことをから、筆者らはセフポドキシムをキードラッグとして、クラブラン酸の存在下でセフポドキシムに対して感性化することを根拠にESBL産生株を検出している。
　さらに詳細にCTX-M- 型の型別を実施する際にはPCR が必要となる。しかし、PCRを実施してもCTX-M-2、CTX-M-3（あるいはCTX-M-1）、CTX-M-8/25およびCTX-M-9のサブグループに分類するのが限界である。これ以上の分類が必要な場合は、bla_CTX-M遺伝子全長のDNA 塩基配列の決定が必須である。CTX-M-型酵素の中には、構造遺伝子の上流あるいは下流にアミノ酸置換を伴う、1塩基のみ変異が認められる酵素が報告されている。したがって、CTX-M-型ESBLの型別に限っては、構造遺伝子全長の塩基配列の決定が不可欠である。bla_CTX-M遺伝子の上流にはISEcp1が存在することが多い。しかし、一部のbla_CTX-M-3サブグループの中にはその上流にDNA inverse やORF2が、bla_CTX-M-9サブグループの中にはISCR1が存在する。一方、下流に存在する遺伝子は多様性に富み、ORF7、ORF477、ORF3、IS903、IS903-like あるいはORFX などが存在する。したがって、bla_CTX-Mをコードする遺伝子全長の塩基配列を決定するには、Cantónらの総説[23]に記載されているbla_CTX-Mのサブグループごとに特徴的な前後の遺伝子（図2）を参考にプライマーを用意して全長を増幅し、ダイレクトシークエンスを試みるのが一つの方法である。現在、筆者らは次世代シークエンサーを用いて耐性因子をコードする遺伝子およびその周辺遺伝子構造を解明しているが、日常検査の一環として病院の検査室で実施できる方法ではない。

　ESBL産生菌による重症感染症の治療に最も実績を有する抗菌薬はカルバペネム系薬である。ESBL産生菌による感染症の第二選択薬としてフルオロキノロン系薬も挙がっている[4]。しかし、上述の理由からESBL産生大腸菌の場合は、フルオロキノロン系薬にも耐性を示す可能性が極めて高く、その有用性は期待できない[18, 20, 21]。薬剤感受性検査成績を見ると、ESBL産生菌の多くがセファマイシン系薬やβ-ラクタマーゼ阻害剤配合薬に感性を示すことから、その有用性について議論されている。しかし、現在に至るまで科学的根拠に基づく十分な検討はなされていない。したがって、現時点において重症感染症の治療にこれらの抗菌薬を使用することには慎重であるべきと考えている。一方で、単純性膀胱炎などの軽症例には抗菌薬を投与しないという選択や、中等症の場合にはセファマイシン系薬やβ-ラクタマーゼ阻害剤配合薬などの投与も考慮してよいのではないかと考えている。

　ESBL産生株はすでに市中に拡散し、健常人が腸管内に保菌しており、抗菌薬投与歴のない健常人がESBL産生菌による尿路感染のみならず血流感染の発症も報告されている[24, 25]。ESBL産生菌は伴侶動物、家畜、食品や環境などからも検出されている[26-28]。健常人は、これらを介してESBL産生菌に曝露されて感染（保菌）した後、感染症が発症すると考えられている。ESBL産生菌は、健常人、入院中の患者を問わず、喫食や伴侶動物との接触を介して保菌する可能性がある。さらに、妊婦がESBL産生株を保菌している場合、新生児が曝露され、感染症を発症する危険性は低くはない[29-31]。このような状況のもと、標準予防策と接触感染予防策でESBL産生菌の感染を防止することは困難である。ESBL産生菌はすでに常在菌化している耐性菌であることを意識して感染対策を実施することが必要である。現時点まで、市中に広がってしまった耐性菌に対する具体的な対応策は示されていない。World Health OrganizationはESBL産生菌について報告された論文を元に、地域とサンプリング時期の形跡を実施している(http://www.who.int/healthinfo/global_burden_disease/definition_regions/en/)。その結果、地域により差異は大きいものの、市中におけるESBL産生菌の保菌率は、2008年以前は10% 以下であったが、現在はそれより高いことが推察されている。特に、タイでは急速に健常人のESBL産生菌の保菌率が上昇し、60%を超えているとの報告もある[25]。本邦の市中におけるESBL産生株の保菌率に関する報告はないので、どのような対策が有用なのか議論することは困難である。しかし、生命予後が不良であると考えられる患者に対しては、標準予防策と接触感染予防策の徹底が必要であると考えられる。

　ESBL産生菌の検出頻度は、現在なお上昇傾向にある。ESBL産生菌が市中に広がる理由を明らかにすることができれば、それに対する対策を講じることが可能となる。現在、多くの研究者は、ESBL産生菌が市中に拡散した理由を解明するための研究を継続している。一日も早く、ESBL産生菌の拡散メカニズムが解明され、制御できる日が来ることを願っている。

1. Knothe, H., et al., Transferable resistance to cefotaxime, cefoxitin, cefamandole and cefuroxime in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Serratia marcescens. Infection, 1983. 11(6): 315-7.
2. Barthélémy, M., et al., Single amino acid substitution between SHV-1 β-lactamase and cefotaxime-hydrolyzing SHV-2 enzyme. FEBS Lett, 1988. 231(1): 217-20.
3. Bush, K. and G.A. Jacoby, Updated functional classification of β-lactamases. Antimicrob Agents Chemother, 2010. 54(3): 969-76.
4. Paterson, D.L. and R.A. Bonomo, Extended-spectrum β-lactamases: a clinical update. Clin Microbiol Rev, 2005. 18(4): 657-86.
5. Nordmann, P., M.F. Lartigue, and L. Poirel, β-lactam induction of ISEcp1B-mediated mobilization of the naturally occurring bla(CTX-M) β-lactamase gene of Kluyvera
ascorbata. FEMS Microbiol Lett, 2008. 288(2): 247-9.
6. Poirel, L., P. Kampfer, and P. Nordmann, Chromosome-encoded Ambler class A β-lactamase of Kluyvera georgiana, a probable progenitor of a subgroup of CTX-M extendedspectrumβ-lactamases. Antimicrob Agents Chemother, 2002. 46(12): 4038-40.
7. Matsumoto, Y., et al., Novel plasmid-mediated β-lactamase from Escherichia coli that inactivates oxyimino-cephalosporins. Antimicrob Agents Chemother, 1988. 32(8): 1243-6.
8. Bauernfeind, A., H. Grimm, and S. Schweighart, A new plasmidic cefotaximase in a clinical isolate of Escherichia coli. Infection, 1990. 18(5): 294-8.
9. Barthélémy, M., et al., Close amino acid sequence relationship between the new plasmid-mediated extended-spectrum β-lactamase MEN-1 and chromosomally encoded
enzymes of Klebsiella oxytoca. Biochim Biophys Acta, 1992. 1122(1): 15-22.
10. Ishii, Y., et al., Cloning and sequence of the gene encoding a cefotaxime-hydrolyzing class A β-lactamase isolated from Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother, 1995.39(10): 2269-75.
11. Bauernfeind, A., et al., Sequences of β-lactamase genes encoding CTX-M-1 (MEN-1) and CTX-M-2 and relationship of their amino acid sequences with those of otherβ
-lactamases. Antimicrob Agents Chemother, 1996. 40(2): 509-13.
12. Livermore, D.M., et al., CTX-M: changing the face of ESBLs in Europe. J Antimicrob Chemother, 2007. 59(2): 165-74.
13. Livermore, D.M. and P.M. Hawkey, CTX-M: changing the face of ESBLs in the UK. J Antimicrob Chemother, 2005. 56(3): 451-4.
14. Bonnet, R., et al., Effect of D240G substitution in a novel ESBL CTX-M-27. J Antimicrob Chemother, 2003. 52(1): 29-35.
15. Karim, A., et al., Plasmid-mediated extended-spectrum β-lactamase (CTX-M-3 like) from India and gene association with insertion sequence ISEcp1. FEMS Microbiol Lett, 2001. 201(2): 237-41.
16. Novais, A., et al., Evolutionary trajectories of β-lactamase CTX-M-1 cluster enzymes: predicting antibiotic resistance. PLoS Pathog, 2010. 6(1): e1000735.
17. Kimura, S., et al., Role of a mutation at position 167 of CTX-M-19 in ceftazidime hydrolysis. Antimicrob Agents Chemother, 2004. 48(5): 1454-60.
18. Banerjee, R. and J.R. Johnson, A new clone sweeps clean: the enigmatic emergence of Escherichia coli sequence type 131. Antimicrob Agents Chemother, 2014. 58(9): 4997-5004.
19. Nicolas-Chanoine, M.H., X. Bertrand, and J.Y. Madec, Escherichia coli ST131, an intriguing clonal group. Clin Microbiol Rev, 2014. 27(3): 543-74.
20. Price, L.B., et al., The epidemic of extended-spectrum β-lactamase producing Escherichia coli ST131 is driven by a single highly pathogenic subclone, H30-Rx. MBio, 2013. 4(6):e00377-13.
21. Olesen, B., et al., Temporal trends in antimicrobial resistance and virulence-associated traits within the Escherichia coli sequence type 131 clonal group and its H30 and H30-Rx subclones, 1968 to 2012. Antimicrob Agents Chemother, 2014. 58(11): 6886-95.
22. Clinical and Laboratory Standards Institute, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. M100-S25. Vol. 35. 2015,
Wayne, Pennsylvania, USA: CLSI.
23. Canton, R., J.M. Gonzalez-Alba, and J.C. Galan, CTX-M Enzymes: Origin and Diffusion. Front Microbiol, 2012. 3: 110.
24. Trecarichi, E.M., R. Cauda, and M. Tumbarello, Detecting risk and predicting patient mortality in patients with extended-spectrum β-lactamase producing Enterobacteriaceae bloodstream infections. Future Microbiol, 2012. 7(10): 1173-89.
25. Woerther, P.L., et al., Trends in human fecal carriage of extended-spectrum β-lactamases in the community: toward the globalization of CTX-M. Clin Microbiol Rev, 2013.26(4):744-58.
26. Ewers, C., et al., Extended-spectrum β-lactamase producing and AmpC-producing Escherichia coli from livestock and companion animals, and their putative impact on public health: a global perspective. Clin Microbiol Infect, 2012. 18(7): 646-55.
27. Lazarus, B., et al., Do human extraintestinal Escherichia coli infections resistant to expanded-spectrum cephalosporins originate from food-producing animals? A systematic review. Clin Infect Dis, 2015. 60(3): 439-52.
28. Michael, G.B., et al., Emerging issues in antimicrobial resistance of bacteria from food-producing animals. Future Microbiol, 2015. 10: 427-43.
29. Dubois, V., et al., CTX-M-producing Escherichia coli in a maternity ward: a likely community importation and evidence of mother-to-neonate transmission. J Antimicrob Chemother, 2010. 65(7): 1368-71.
30. Eppes, C.S. and S.L. Clark, Extended-spectrum β-lactamase infections during pregnancy: a growing threat. Am J Obstet Gynecol, 2015. [Epub ahead of print] doi: 10.1016/j.ajog.2015.03.020.
31. Kristóf, K., et al., Extended-spectrum β-lactamase producing Klebsiella spp.